看到細胞修復的過程
由於臭氧層的破壞日趨嚴重,人類受日光中紫外線照射的機率也隨著增加。紫外線會傷害細胞內的去氧核醣核酸(DNA),若不加以修護,可能導致基因突變或癌症的發生。幸好人類細胞有一套修復機制,可修復這種因紫外線照射所造成的DNA傷害。最近有一項漸受研究者採用的實驗技術--微孔紫外線照射(micropore UV irradiation),這項實驗技術配合一般免疫螢光染色法,便可以觀察修復機制在細胞中運作的情形。
微孔紫外線照射技術最初是由日本森俊雄(Toshio Mori)博士及其同仁於 2001 年提出的(J. Invest. Dermatol. 117(2001)1156?1161),他們利用實驗室常用的濾膜(平時用來過濾分子或細菌)做為濾鏡,讓紫外線只能穿過 3 ~ 5 微米(μm)的孔洞,使得被照細胞的 DNA 只有局部受傷,再輔以傳統的免疫螢光染色,就可以觀察到不同時間及空間下活細胞 DNA 受傷後的修補過程。
細胞的自我修復機制
過度曝曬紫外線除了造成皮膚變黑與老化之外,也可能導致基因突變或細胞癌化。當細胞受到短波長紫外線照射後,會產生兩種主要的 DNA 傷害,即環丁嘧啶二聚體(簡稱 CPD)和嘧啶 6?4 二聚體(簡稱 6?4PP),這二者都是 DNA 分子鹼基(嘧啶)間異常的鍵結物。
細胞中有一套修復機制,即核酸切割修補(nucleotide excision repair, NER),能夠修復這些 DNA 傷害。NER 是一種由一系列修復蛋白質所參與的機制,當 DNA 傷害產生後,修復蛋白便會前去辨識,再經由切除、填補、黏合等步驟完成修復。
幫助細胞修復
在人群中有些人帶著體隱性遺傳疾病,例如色素性乾皮症(Xeroderma Pigmentosum, XP),由於缺乏某種正常的 NER 基因,無法像正常人一樣修復這些 DNA 傷害,因此他們對光照非常敏感。這些 XP 病患除了有皮膚癌高罹患率的顧慮外,也容易有其他體內器官癌變的隱憂。過去學者在研究細胞中的 DNA 修復機制時,由於傷害範圍太大無法清楚觀察細胞的修復運作,現在因為有微孔紫外線照射技術,上述的困擾就得以解決。
我們可以藉由這種技術,僅允許部分紫外線從濾膜上的小孔洞穿過,把 DNA 傷害局限在核的某一小區域,以便觀察修復蛋白集合到傷害區域的情形。藉上述方法對細胞進行微孔紫外線照射之後,移除濾膜讓細胞修護一段時間,再利用可以辨識 CPD 或 6?4PP 的抗體,或者是修復蛋白的抗體進行免疫螢光染色,以便觀察 DNA 損壞與修復蛋白共位(co-localization)的情形。
免疫螢光染色法是先以專一性高的一級抗體來辨識標的物,再給予帶有螢光的二級抗體來辨識一級抗體,如此,經由觀察螢光顯微鏡所看到的螢光訊號,便可以找到標的物的位置。
DNA 修復過程的實例
以人類纖維母細胞 MSU?1 為實驗材料,在薄膜覆蓋下進行微孔紫外線照射(波長 254 奈米,能量密度是 100 焦耳/平方公尺),30 分鐘後,利用 CPD 抗體和修復蛋白 XPB 抗體進行螢光染色。XPB 具有核酸解旋?活性,在 NER 過程中負責解開 DNA 雙股螺旋以利切除傷害的部位。
首先對某一視野的所有細胞核以 DAPI 染色,DAPI 是一種有機小分子,可以插入雙股 DNA 的溝槽中形成 DNA?DAPI 複合物,由於它會吸收特定波長而釋放藍色螢光,因此可用來確定 DNA 的位置。接著在同一視野內以 CPD 抗體螢光染色,因其二級抗體帶有釋放紅色螢光的探針,所以訊號是紅色。當部分細胞核內含紅色顆粒狀螢光訊號時,就表示細胞核受到局部傷害。
在同一視野內再以 XPB 抗體螢光染色,因其二級抗體帶有釋放綠色螢光的探針,所以它的訊號是綠色,受傷部分的細胞核內會呈現顆粒狀綠色訊號。把利用 CPD 染色的照片與利用 XPB 染色的照片重疊,照片上的綠色訊號和紅色訊號恰好在同一位置,表示 XPB 和 CPD 的位置是一致的,因此可知 MSU?1 細胞經紫外線照射後,隔 30 分鐘就有修復蛋白 XPB 到 DNA 損害處進行修復。
以中國倉鼠卵巢細胞 CHO?KI 及帶有 NER 缺陷的同源細胞株 UV24 做為實驗材料,進行紫外線局部照射。這二種實驗材料經紫外線照射後,立刻用 6?4PP 抗體進行免疫螢光染色,可以看到細胞受到局部傷害的訊號。若讓細胞經過九小時的修復,便已無法在 CHO?KI 中偵測到 6?4PP 的訊號。然而以同樣方式處理 UV24 細胞,6?4PP 的螢光訊號仍然存在,顯示 CHO?KI 在這段時間可以完全修復細胞的 6?4PP 傷害,UV24 細胞則不能。
眼見為憑
我們常說「眼見為憑」,紫外線局部照射加上免疫螢光染色的研究技術,似乎可以替這句成語作註解。新技術協助我們對格物致知的真理追求,真正「看見」DNA損傷與修復的過程。
上述的兩個實驗只是當作例子說明,這項新技術的應用當然不只是如此。另一方面值得一提的是,NER 除了修補因短波紫外線造成的 DNA 損傷外,也負責修補其他許多化學物質如吸菸、油煙、藥物所造成的 DNA 損傷,因此核酸切割修補的效率與我們健康息息相關,不單只是對付紫外線曝曬的問題而已。